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口服用于治疗敏感菌所致的肠道感染及用作肠道手术前准备，并有减少肠道细菌产生氨的作用，对肝硬化消化道出血病人的肝昏迷有一定防止作用。肌注用于敏感菌所致的系统感染，如肺炎、败血症、尿路感染等。
稀释到一定浓度的卡那霉素喷施于棉花叶子上，可用于鉴定是否为转Bt基因抗虫棉，叶子发黄不抗棉铃虫，不变色则为抗虫棉。
大肠杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌的一些菌株对本品敏感。
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绿脓杆菌，革兰阳性菌、厌氧菌、非典型性分支杆菌、立克次体、真菌、病毒等对本品均耐药。微生物对本品与其他氨基糖苷类药物间存在有一定的交叉耐药性。
卡纳霉素一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30秒核糖体结合从而致使mRNA密码误读。若细菌中产生一种破坏卡那霉素的酶，则可变为抗性株。卡那霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。