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丙酮酸羧化酶是糖异生途径的关键酶。丙酮酸羧化酶存在于线粒体中，是催化下列不可逆反应的酶。丙酮酸羧化酶EC6．4．1．1．丙酮酸+CO2+ATP+H2O→草酰乙酸+ADP+Pi，ΔGo′=-0.5kcal．广泛存在于动物、霉菌和酵母中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。在三羧酸循环中，它是供给草酰乙酸的主要补充反应。为一种变构酶，有乙酰CoA时，其活性存在，同时含有生物素作为和CO2反应的酶的辅酶。分子量约65万，有很多亚基。最适pH为4.8。
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