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伊红-美蓝培养基常用来鉴别大肠杆菌，其原理是大肠杆菌能分解乳糖产生大量的混合酸，菌体带H+故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽，在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合。
当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。
在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。
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常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。