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蝙蝠全身骨质轻，头骨愈合程度较高，肩带发达，胸骨具龙骨状突起。后肢胫骨、腓骨退化。耳壳发达，常具发达的耳屏或对耳屏。翼膜、耳、唇等处有丰富的感觉毛。颜色多样，大多是褐色、灰色和黑色。
蝙蝠前肢特化，尤其是骨骼有较大的变化。肱骨显著短于桡骨（前臂骨），尺骨退化；除第一指不特别延长，末端有爪，其余掌骨和指骨均特别延长，各掌、指骨间生有皮膜，向后一直与后肢和尾部相连。连接各指间的皮膜称翼膜，前肢肱骨和后肢间皮膜称侧膜，前肢肱骨和前臂骨前的皮膜称前翼膜，连接左右后肢和尾部的称股间膜。股间膜其膜缘常有距，起支撑股间膜作用，距外侧皮膜称之为距缘膜。后肢短小，大腿部与身体呈直角且位于同一平面。侧膜常止于胫下部、踵部或趾基部。后肢足部完全位于皮膜以外，五趾均具爪，用于钩挂。
蝙蝠牙齿齿冠原始，原始齿型相比，缺第一对门齿和第一对前白齿。门齿弱，犬齿发达，基部常有粗壮的基嵴。前臼齿有分化，最后一枚前臼齿显著的大，其齿尖可达犬齿齿尖的高度，臼齿齿冠呈“W”形。
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蝙蝠雄性具有显著的阴茎，但一般无阴囊，睾丸留于腹腔内或会阴部。雌性具双分子宫或双子宫，繁殖时形成盘状胎盘。胸部有一对乳头。耳壳发达，常具发达的耳屏或对耳屏。翼膜、耳、唇等处有丰富的感觉毛。